{"id":765,"date":"2018-02-24T18:52:59","date_gmt":"2018-02-24T17:52:59","guid":{"rendered":"http:\/\/wpd.ugr.es\/~evoflor\/?p=765"},"modified":"2018-10-30T09:04:18","modified_gmt":"2018-10-30T08:04:18","slug":"protocol-vegetal-dna-extraction","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/wpd.ugr.es\/~evoflor\/?p=765","title":{"rendered":"Protocol: plant DNA extraction"},"content":{"rendered":"

Protocolo de extracci\u00f3n de ADN vegetal con el Genelute Plant Genomic DNA Miniprep kit<\/em> de Sigma-Aldrich (Ref. G2N70).<\/p>\n

<\/p>\n

Protocolo en PDF<\/a><\/p>\n

Sigma user guide<\/a><\/p>\n

Troubleshooting guide<\/a><\/p>\n

 <\/p>\n

Nota: Si el kit es nuevo es necesario preparar (diluir con etanol) la wash solution<\/em>.<\/p>\n\n\n\n
Equipos necesarios<\/strong><\/span><\/p>\n

 <\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Molino de bolas<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 V\u00f3rtex<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Ba\u00f1o calefactado<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Microcentr\u00edfuga<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Congelador<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Nanodrop (para cuantificar)<\/span><\/td>\n

Material<\/strong><\/span><\/p>\n

 <\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Kit de extracci\u00f3n<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Adaptadores molino de bolas<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Bolas (acero) para el molino<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Pipetas (P200; P1000)<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Puntas azules (P1000) y amarillas (P200)<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Tubos eppy de 1.5 y 2 ml<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Gradillas flotantes y normales<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Hielo<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Cron\u00f3metro<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Etiquetas para los eppys<\/span><\/p>\n

\u00b7\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Gradilla\/caja de congelaci\u00f3n<\/span><\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n

\"\"<\/p>\n

Pasos a seguir<\/strong><\/p>\n

\u2610<\/strong> 1.<\/strong> Preparaci\u00f3n del material vegetal. Introducir en tubos de 2 ml:<\/p>\n

– Unos 65 mg de material vegetal (si se trata de hojas secas)<\/p>\n

– Unos 100 mg de material vegetal (si se trata de material fresco)<\/p>\n

Esto va a ser opcional. Para mayor rapidez se pueden introducir unas cuantas hojas por tubo.<\/p>\n

En cada tubo se colocar\u00e1n 2 bolitas de acero y se introducir\u00e1n en los adaptadores para el molino de bolas.<\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 <\/strong>2.<\/strong> Precalentar un ba\u00f1o a 65\u00baC<\/strong>. Introducir en \u00e9l la Elution Solution<\/strong>. Comprobar los reactivos, de modo que si alguno ha formado precipitados, calentarlo en el ba\u00f1o hasta que estos desaparezcan y luego dejarlo enfriar a temperatura ambiente.<\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 <\/strong>3.<\/strong> Colocar los adaptadores con los tubos en el molino de bolas y agitar 1 minuto<\/strong> a 25 rps, aproximadamente. Repetir si es necesario, hasta que todo el material est\u00e9 molido.<\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 <\/strong>4.<\/strong>\u00a0\u00a0 A\u00f1adir a cada tubo 350 \u00b5l de Lysis Solution [Part. A]<\/strong>, agitar con el dedo para que se mezcle bien.<\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 <\/strong>5.<\/strong>\u00a0\u00a0 A\u00f1adir, entonces, 50 \u00b5l de Lysis Solution [Part. B]<\/strong>, vortear vigorosamente e invertir varias veces.<\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 <\/strong>6.<\/strong> Incubar a 65\u00baC durante 15 minutos<\/strong>.
\nInvertir suavemente los tubos varias veces cada 5 minutos<\/strong>, para disolver el precipitado que se form\u00f3 en el paso anterior.<\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 7.<\/strong> A\u00f1adir 130 \u00b5l<\/strong> de Precipitation Solution<\/strong>, mezclar por inversi\u00f3n e incubar 5 minutos<\/strong> en hielo<\/u>. A continuaci\u00f3n, centrifugar a m\u00e1xima velocidad durante 5 minutos<\/strong>.<\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 <\/strong>8.<\/strong> Colocar los tubos con las columnas azules<\/u><\/em> en la gradilla y a\u00f1adir a cada uno de ellos el sobrenadante obtenido, pipeteando con cuidado para no remover el fondo e intentando no llevarnos restos vegetales.
\nCentrifugar a m\u00e1xima velocidad 1 minuto<\/strong>.<\/p>\n

NOTA:<\/em><\/strong> Los tubos donde est\u00e1n los restos vegetales debemos conservarlos, puesto que dentro llevan las bolitas de acero que ser\u00e1n reutilizadas. <\/em><\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 <\/strong>9.<\/strong> Colocar los tubos con las columnas rojas<\/u><\/em> en la gradilla y a\u00f1adir a cada uno 550 \u00b5l<\/strong> de Column Preparation Solution<\/strong>. Centrifugar a 12.000 rpm 1 minuto.<\/strong> Descartar el eludido.<\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 <\/strong>10.<\/strong> Sacar la columna azul para desecharla y a\u00f1adir a cada tubo 700 \u00b5l<\/strong> de Binding Solution<\/strong>. Mezclar inmediatamente por inversi\u00f3n.<\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 <\/strong>11.<\/strong> Pipetear cuidadosamente 700 \u00b5l<\/strong> de la mezcla<\/u> anterior y a\u00f1adirlos a los tubos con la columna roja.<\/p>\n

Centrifugar a m\u00e1xima velocidad 1 minuto<\/strong>. Desechar el eludido, volver a colocar la columna y repetir con el remanente del paso anterior.<\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 <\/strong>12.<\/strong> A\u00f1adir 500 \u00b5l<\/strong> de Wash Solution<\/strong> y centrifugar a m\u00e1xima velocidad durante 3 minutos<\/strong>. Descartar el eludido y repetir la operaci\u00f3n otra vez, secando, finalmente, cualquier fluido que quede adherido a la columna.<\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 <\/strong>13.<\/strong> Colocar la columna roja en un tubo de 1,5 ml. (Se puede centrifugar de esta manera 1 minuto, para eliminar restos de Wash Solution que pudieran quedar<\/em>).\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 A\u00f1adir 50 \u00b5l<\/strong> de Elution Solution<\/strong> (precalentado a 65\u00baC) a la columna, incubar 5 minutos<\/strong> y centrifugar a m\u00e1xima velocidad 1 minuto<\/strong>. Repetir esta operaci\u00f3n una vez m\u00e1s.
\nSi, por alg\u00fan motivo, sabemos que podemos tener poca cantidad de ADN, una opci\u00f3n es a\u00f1adir menor cantidad de Elution Solution en la primera al\u00edcuota (a), para que as\u00ed est\u00e9 m\u00e1s concentrado.<\/em><\/p>\n

 <\/p>\n

\u2610 <\/strong>14.<\/strong> Etiquetar correctamente y guardar en el congelador <\/strong>si no se va a cuantificar en el momento.<\/p>\n

 <\/p>\n

La etiqueta debe indicar, al menos, los c\u00f3digos del esp\u00e9cimen, la fecha, las iniciales de la persona que realizo el procedimiento y la concentraci\u00f3n. No utilizar rotuladores cuya tinta pueda perder legibilidad con la humedad.<\/p>\n

Ejemplo de etiqueta:<\/p>\n

Em21-11-78\u00a0 ——- \u00a0indica Especie (Em) y poblaci\u00f3n (21) \u2013 a\u00f1o de colecta (2011) \u2013 individuo (78)<\/span>
\n15\/02\/2018\/FP\u00a0——- \u00a0fecha de la extracci\u00f3n e iniciales del t\u00e9cnico<\/span>
\n20 ng\/\u00b5l \u00a0\u00a0\u00a0 \u00a0——- \u00a0concentraci\u00f3n<\/span><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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