Las micotoxinas son metabolitos secundarios tóxicos, de composición variada, producidos por diferentes hongos. Suelen contaminar alimentos, piensos, o las materias primas utilizadas para su elaboración, pudiendo afectar a la salud tanto de humanos como de animales. Debido a su gran variedad de efectos tóxicos, y sobre todo a su extrema resistencia al calor (termorresistencia), la presencia de micotoxinas en los alimentos es considerada de alto riesgo.
La contaminación de los alimentos con micotoxinas depende de las condiciones ambientales, que pueden propiciar el crecimiento del hongo y por ende la producción de las toxinas. Por tanto, la mayoría de los productos agrícolas pueden ser susceptibles de contaminación casi en cualquier momento, desde su producción en el campo, durante la cosecha, en el transporte y en el almacenamiento.
Como resultado, la legislación a nivel europeo sobre seguridad alimentaria es cada vez más restrictiva en cuanto a los niveles de micotoxinas en alimentos y ha establecido contenidos máximos de estos compuestos que no deben ser superados con objeto de garantizar la calidad del producto y permitir su distribución y consumo.
Considerando las recientes e importantes mejoras de las técnicas separativas en cuanto a miniaturización y aumento de la eficacia, y con objeto de explorar sus indudables ventajas (bajo consumo de disolventes, alta sensibilidad, elevada resolución, tiempos de análisis reducidos y baja cantidad de muestra), en esta Tesis Doctoral se proponen nuevos métodos analíticos para la determinación de micotoxinas empleando técnicas de separación miniaturizadas (CE y HPLC capilar) y de alta eficacia (UHPLC) con objeto de explorar las ventajas mencionadas. Estas técnicas, acopladas a sistemas de detección altamente sensibles y selectivos, como LIF o MS/MS, permiten la cuantificación e identificación inequívoca de estos compuestos a las bajas concentraciones esperadas en estas matrices.
Por otro lado, es de gran importancia disponer de técnicas que permitan el estudio del metaboloma de los hongos implicados en la producción de micotoxinas y otros metabolitos secundarios, para conocer los genes productores o para determinar nuevos metabolitos, lo que podría ayudar a desarrollar estrategias para evitar la aparición de micotoxinas. En esta Tesis, se han empleado HRMS y MSn para el estudio del metaboloma de varios hongos.
A continuación se describe brevemente el trabajo desarrollado:
- En el primer capítulo se describe el método desarrollado para la determinación de las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 en muestras de arroz utilizando la cromatografía capilar electrocinética micelar (MEKC) con detección LIF y preconcentración
online. - En el segundo capítulo se ha llevado a cabo una comparación de diversos tratamientos de muestra para la determinación de ocratoxina A en diferentes tipos de vino, como son la microextracción líquido – líquido dispersiva (DLLME) empleando disolventes orgánicos y líquidos iónicos como extractantes (IL-DLLME), y la metodología QuEChERS (acrónimo formado a partir de los términos en inglés: Rápido, Eficaz, Barato, Fácil, Robusto, Seguro). En este caso, la técnica instrumental empleada ha sido la HPLC capilar – LIF, añadiendo a la fase móvil un medio micelar aniónico para aumentar la intensidad de la fluorescencia y mejorar la eficacia.
- En el capítulo tercero se ha llevado a cabo la determinación de 15 micotoxinas (incluyendo aflatoxinas, fumonisinas, tricotecenos, ocratoxina A, citrinina, esterigmatocistina y zearalenona) en cardo mariano (Silybum marianum). Para ello, se ha utilizado UHPLC – MS/MS para el análisis instrumental, mientras que el tratamiento de la muestra consistió en un primer paso basado en el procedimiento QuEChERS, que permitía la determinación de 5 micotoxinas (fumonisina B1, fumonisina B2, nivalenol, deoxinivalenol y fusarenona -X) y una posterior limpieza basada en la DLLME para la determinación del resto de las micotoxinas.
- Para demostrar el potencial de la UHPLC – MS/MS junto con el tratamiento de muestra QuEChERS, en el cuarto capítulo se han desarrollado y caracterizado dos métodos sensibles, simples y rápidos para la determinación de 15 micotoxinas (aflatoxina B1, aflatoxina B2, aflatoxina G1, aflatoxina G2, ocratoxina A, fumonisina B1, fumonisina B2, nivalenol, deoxinivalenol, fusarenona – X, toxina T-2 y HT-2, citrinina, esterigmatocistina y zearalenona) en cereales (espelta, arroz blanco, arroz integral y arroz rojo) y pseudocereales (trigo sarraceno, quinoa y amaranto) y de 10 micotoxinas (ocratoxina A, fumonisina B1, fumonisina B2, deoxynivalenol,
fusarenona – X, toxina T-2 y HT-2, citrinina, esterigmatocistina y zearalenona) en melazas (de arroz, trigo y cebada). - El capítulo quinto describe un método de análisis para la determinación de 14 micotoxinas en muestras de frutos secos (almendras, cacahuetes, semillas de girasol, semillas de calabaza, nueces, nueces de macadamia, pistachos, avellanas y piñones). De forma similar al capítulo tercero, el tratamiento de muestra comprende una primera etapa basada en el procedimiento QuEChERS para la determinación de las fumonisinas B1 y B2, deoxinivalenol, fusarenona – X, toxinas T-2 y HT-2, citrinina, esterigmatocistina, zearalenona y ocratoxina A y una posterior etapa de limpieza basada en la DLLME para la determinación de las aflatoxinas (B1, B2, G1 y G2).
- En capítulo sexto, se ha desarrollado un nuevo enfoque basado en cromatografía de líquidos (LC) acoplada a HRMS y LC-MSn, para la identificación de alcaloides ergóticos nuevos o poco explorados en muestrasde cereales.
- Finalmente, en el último capítulo se han determinado los metabolitos producidos por el cluster 27 pks (pks27) en el Aspergillus flavus usando LC-HRMS y LC-MSn. Asimismo, se ha estudiado por primera vez el patrón de fragmentación de estos compuestos usando ionización por electrospray en modo negativo. Este trabajo, junto con el correspondiente al capítulo sexto, han sido llevados a cabo en la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Gante (Bélgica).
