FQM-302's blog

Las micotoxinas son metabolitos secundarios tóxicos, de composición variada, producidos por diferentes hongos. Suelen contaminar alimentos, piensos, o las materias primas utilizadas para su elaboración, pudiendo afectar a la salud tanto de humanos como de animales. Debido a su gran variedad de efectos tóxicos, y sobre todo a su extrema resistencia al calor (termorresistencia), la presencia de micotoxinas en los alimentos es considerada de alto riesgo.

La contaminación de los alimentos con micotoxinas depende de las condiciones ambientales, que pueden propiciar el crecimiento del hongo y por ende la producción de las toxinas. Por tanto, la mayoría de los productos agrícolas pueden ser susceptibles de contaminación casi en cualquier momento, desde su producción en el campo, durante la cosecha, en el transporte y en el almacenamiento.

Como resultado, la legislación a nivel europeo sobre seguridad alimentaria es cada vez más restrictiva en cuanto a los niveles de micotoxinas en alimentos y ha establecido contenidos máximos de estos compuestos que no deben ser superados con objeto de garantizar la calidad del producto y permitir su distribución y consumo.

Considerando las recientes e importantes mejoras de las técnicas separativas en cuanto a miniaturización y aumento de la eficacia, y con objeto de explorar sus indudables ventajas (bajo consumo de disolventes, alta sensibilidad, elevada resolución, tiempos de análisis reducidos y baja cantidad de muestra), en esta Tesis Doctoral se proponen nuevos métodos analíticos para la determinación de micotoxinas empleando técnicas de separación miniaturizadas (CE y HPLC capilar) y de alta eficacia (UHPLC) con objeto de explorar las ventajas mencionadas. Estas técnicas, acopladas a sistemas de detección altamente sensibles y selectivos, como LIF o MS/MS, permiten la cuantificación e identificación inequívoca de estos compuestos a las bajas concentraciones esperadas en estas matrices.

Por otro lado, es de gran importancia disponer de técnicas que permitan el estudio del metaboloma de los hongos implicados en la producción de micotoxinas y otros metabolitos secundarios, para conocer los genes productores o para determinar nuevos metabolitos, lo que podría ayudar a desarrollar estrategias para evitar la aparición de micotoxinas. En esta Tesis, se han empleado HRMS y MSⁿ para el estudio del metaboloma de varios hongos.

A continuación se describe brevemente el trabajo desarrollado:

1. En el primer capítulo se describe el método desarrollado para la determinación de las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 en muestras de arroz utilizando la cromatografía capilar electrocinética micelar (MEKC) con detección LIF y preconcentración
   online.

2. En el segundo capítulo se ha llevado a cabo una comparación de diversos tratamientos de muestra para la determinación de ocratoxina A en diferentes tipos de vino, como son la microextracción líquido – líquido dispersiva (DLLME) empleando disolventes orgánicos y líquidos iónicos como extractantes (IL-DLLME), y la metodología QuEChERS (acrónimo formado a partir de los términos en inglés: Rápido, Eficaz, Barato, Fácil, Robusto, Seguro). En este caso, la técnica instrumental empleada ha sido la HPLC capilar – LIF, añadiendo a la fase móvil un medio micelar aniónico para aumentar la intensidad de la fluorescencia y mejorar la eficacia.

3. En el capítulo tercero se ha llevado a cabo la determinación de 15 micotoxinas (incluyendo aflatoxinas, fumonisinas, tricotecenos, ocratoxina A, citrinina, esterigmatocistina y zearalenona) en cardo mariano (Silybum marianum). Para ello, se ha utilizado UHPLC – MS/MS para el análisis instrumental, mientras que el tratamiento de la muestra consistió en un primer paso basado en el procedimiento QuEChERS, que permitía la determinación de 5 micotoxinas (fumonisina B1, fumonisina B2, nivalenol, deoxinivalenol y fusarenona -X) y una posterior limpieza basada en la DLLME para la determinación del resto de las micotoxinas.

4. Para demostrar el potencial de la UHPLC – MS/MS junto con el tratamiento de muestra QuEChERS, en el cuarto capítulo se han desarrollado y caracterizado dos métodos sensibles, simples y rápidos para la determinación de 15 micotoxinas (aflatoxina B1, aflatoxina B2, aflatoxina G1, aflatoxina G2, ocratoxina A, fumonisina B1, fumonisina B2, nivalenol, deoxinivalenol, fusarenona – X, toxina T-2 y HT-2, citrinina, esterigmatocistina y zearalenona) en cereales (espelta, arroz blanco, arroz integral y arroz rojo) y pseudocereales (trigo sarraceno, quinoa y amaranto) y de 10 micotoxinas (ocratoxina A, fumonisina B1, fumonisina B2, deoxynivalenol,
   fusarenona – X, toxina T-2 y HT-2, citrinina, esterigmatocistina y zearalenona) en melazas (de arroz, trigo y cebada).

5. El capítulo quinto describe un método de análisis para la determinación de 14 micotoxinas en muestras de frutos secos (almendras, cacahuetes, semillas de girasol, semillas de calabaza, nueces, nueces de macadamia, pistachos, avellanas y piñones). De forma similar al capítulo tercero, el tratamiento de muestra comprende una primera etapa basada en el procedimiento QuEChERS para la determinación de las fumonisinas B1 y B2, deoxinivalenol, fusarenona – X, toxinas T-2 y HT-2, citrinina, esterigmatocistina, zearalenona y ocratoxina A y una posterior etapa de limpieza basada en la DLLME para la determinación de las aflatoxinas (B1, B2, G1 y G2).

6. En capítulo sexto, se ha desarrollado un nuevo enfoque basado en cromatografía de líquidos (LC) acoplada a HRMS y LC-MSⁿ, para la identificación de alcaloides ergóticos nuevos o poco explorados en muestrasde cereales.

7. Finalmente, en el último capítulo se han determinado los metabolitos producidos por el cluster 27 pks (pks27) en el Aspergillus flavus usando LC-HRMS y LC-MSⁿ. Asimismo, se ha estudiado por primera vez el patrón de fragmentación de estos compuestos usando ionización por electrospray en modo negativo. Este trabajo, junto con el correspondiente al capítulo sexto, han sido llevados a cabo en la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Gante (Bélgica).

En esta Tesis se han desarrollado diferentes métodos analíticos para la determinación de residuos de herbicidas y cefalosporinas, en alimentos y muestras ambientales. Para ello, se han evaluado diferentes técnicas separativas miniaturizadas, como la electroforesis capilar (CE) y la cromatografía líquida capilar (HPLC capilar). Además se han propuesto tratamientos de muestra alternativos a los existentes en bibliografía obteniéndose un incremento en la eficacia y una disminución del tiempo invertido en la etapa de tratamiento de muestra.

En el primer capítulo de esta Tesis doctoral, se ha desarrollado un método para la determinación de los principales productos de degradación del metribuzin, utilizando la electroforesis capilar en zona (CZE) con detección UV. Con el fin de aumentar la sensibilidad de la técnica se ha aplicado un método de preconcentración dentro del propio capilar, denominado apilamiento de gran volumen de muestra (LVSS) con polaridad inversa. El método propuesto se ha aplicado a muestras de suelo previa extracción de los compuestos de interés mediante extracción líquida presurizada (PLE), seguida de una etapa de limpieza y preconcentración basada en el empleo de la extracción en fase sólida (SPE). Para su aplicación en muestras de agua subterránea, se necesitó sólo una etapa de SPE antes del análisis mediante LVSS-CZE. Además se han calculado los valores de las constantes de disociación (pKa) de estos compuestos utilizando CZE y los valores obtenidos se han comparado con los valores recogidos en bibliografía.

Para demostrar el potencial de la metodología LVSS-CZE-UV, en el segundo capítulo se han determinado cinco sulfonilureas en muestras de uva, donde este tipo de herbicidas se aplica frecuentemente, y también en aguas. En este caso, se utilizó la SPE con relleno de HLB en las muestras de agua y para las muestras de uva se usó C18.

El tercer capítulo presenta un nuevo método para la determinación de cinco cefalosporinas en muestras de agua. En este caso la SPE ha sido utilizada como procedimiento de preconcentración en discontinuo, combinado con LVSS como procedimiento de preconcentración en línea acoplado a CZE con detección UV. El aspecto más notable de esta metodología es la obtención de bajos límites de detección, lo que permite su aplicación a las matrices estudiadas donde estos residuos presentan niveles de concentración muy bajos.

La determinación de ocho cefalosporinas en muestras de carne y agua de distinta procedencia se ha desarrollado en el capítulo cuarto. Para ese propósito, se utilizó la HPLC capilar con detección UV como técnica instrumental y la extracción líquido-líquido asistida por sales (SALLE) para el tratamiento de la muestra. La formación previa de un par iónico entre las cefalosporinas y el bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) ha mejorado la eficacia de la extracción.

En el quinto capítulo, se describe la síntesis y eficacia de un polímero impreso molecularmente (MIP) para la extracción específica de tres cefalosporinas en muestras de leche, utilizando HPLC-UV para las medidas analíticas. Este trabajo ha sido desarrollado en el Institut de Chimie Organique et Analytique (CIAO) Université d’Orléans (Orleans, Francia) durante una estancia predoctoral.

La revisión bibliográfica acerca de la determinación de cefalosporinas llevada a cabo antes del establecimiento de los nuevos métodos analíticos incluidos en esta Tesis ha permitido elaborar un artículo de revisión donde se discuten los métodos analíticos existentes para la determinación de β-lactamas haciendo uso de HPLC con diferentes sistemas de detección, en diferentes áreas y con tratamientos de muestra distintos.

En esta Tesis se han desarrollado diferentes métodos para la determinación de residuos de carbamatos en alimentos y muestras medioambientales. En el caso de los alimentos, la legislación vigente establece para los carbamatos y otros contaminantes unos Límites Máximos de Residuos (MRLs) que no deben ser superados con objeto de garantizar la calidad del producto y permitir su distribución y consumo. En el caso de las aguas, el interés de la determinación de carbamatos es un hecho contrastado, ya que el uso de plaguicidas, incluidos los carbamatos, está muy extendido, y si se utilizan mal o en exceso, los plaguicidas pueden contaminar el agua, la atmósfera y el suelo y de este modo pueden entrar en la cadena alimentaria y provocar efectos desfavorables en la salud humana. Considerando las recientes e importantes mejoras de las técnicas separativas en cuanto a miniaturización y aumento de la eficacia, y con objeto de explorar sus indudables ventajas (bajo consumo de disolventes, alta sensibilidad, elevada resolución, tiempos de análisis reducidos y baja cantidad de muestra), en esta Tesis Doctoral se proponen nuevos métodos analíticos para la determinación de residuos de carbamatos empleando técnicas de separación miniaturizadas, como la electroforesis capilar (CE) y la cromatografía líquida capilar (HPLC capilar), y de alta eficacia (como la cromatografía líquida de ultra resolución, UHPLC) con objeto de explorar las ventajas mencionadas. Estas técnicas, acopladas a sistemas de detección como la espectrofotometría ultravioleta visible (UV-Vis) y la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) permiten la cuantificación e identificación inequívoca de estos compuestos a las bajas concentraciones esperadas en estas matrices.

A continuación se describe brevemente el trabajo desarrollado:

• En el primer capítulo se describe el método desarrollado para la determinación de seis carbamatos en muestras vegetales (pepino) y aguas de diversa  procedencia mediante HPLC capilar-UV como técnica instrumental y extracción en fase sólida (SPE) como técnica de tratamiento de muestra, con diferentes tipos de sorbentes dependiendo de la matriz.
• En el segundo capítulo se propone la determinación de doce carbamatos en diferentes zumos de frutas empleando la CE-UV. Para aumentar la sensibilidad del método se aplicaron técnicas de preconcentración dentro del capilar (on-line) como el denominado barrido (sweeping), consiguiéndose también la preconcentración previa (off-line) de los analitos mediante la microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME).
• En el tercer capítulo se propuso el acoplamiento CE-MS empleando una interfase de flujo coaxial o sheath-flow y un surfactante volátil como electrolito de fondo, para la determinación de diecisiete carbamatos en aguas de diversa procedencia y la DLLME como tratamiento de muestra.
• En siguiente capítulo se recoge el trabajo desarrollado durante la estancia predoctoral en la Universidad de Utrecht (Holanda), que consistió en la evaluación de un prototipo de interfase sin flujo adicional (sheathless) para el acoplamiento CE-MS. El método desarrollado se aplicó a los mismos analitos considerados en el capítulo anterior y se validó para aguas destinadas al consumo humano.
• El quinto capítulo describe un método de análisis para la determinación de
  veinticinco carbamatos en muestras de vino. Para ello se desarrolló un método
  UHPLC-MS/MS que permitió la separación cromatográfica de estos plaguicidas en menos de cinco minutos con eficacias muy elevadas. Además se propuso un nuevo tratamiento de muestra llamado microextracción asistida por ultrasonidos con emulsificación mejorada con surfactante (UASEME), escasamente explorado en el análisis de alimentos.
• Finalmente, en el último capítulo se evaluó la metodología QuEChERS para el
  análisis de treinta y tres carbamatos en productos botánicos empleando de nuevo
  UHPLC-MS/MS.

En esta Tesis se han desarrollado diferentes métodos para la determinación de
contaminantes, Qns y otros residuos, en alimentos y muestras medioambientales.
Para ello se han evaluado diferentes técnicas instrumentales separativas, la CE, la
HPLC capilar y la UHPLC, acopladas a diferentes métodos de detección de gran
sensibilidad y selectividad como son la fluorescencia inducida por laser (LIF), la
espectrometría de masas en tándem (MS/MS) y la espectrometría de masas de alta
resolución (HRMS). Además se han estudiado y propuesto metodologías de
tratamientos de muestra alternativas a las ya existentes que permitan aumentar la
eficacia y el rendimiento de los tratamientos.

En el primer capítulo se ha desarrollado un método para la determinación de 6
quinolonas de uso veterinario y humano en aguas utilizando la CE-LIF como técnica
instrumental y la extracción en fase solida como método de tratamiento de muestra
comparando diferentes sorbentes.

Para demostrar el potencial de la CE-LIF con muestras de mayor complejidad, en el
segundo capítulo se determinaron 4 quinolonas de uso veterinario en muestras de
leche de vaca y riñón de cerdo, empleando la extracción en fase solida con polímeros
impresos molecularmente (MIPSPE) para la extracción y limpieza de la muestra.

En el tercer capítulo se ha llevado a cabo una comparación de dos tratamientos de
muestra, MIPSPE y QuEChERS, para la determinación de 7 quinolonas en leche. En
este caso, la técnica instrumental empleada ha sido la HPLC capilar-LIF.

En el capítulo cuarto se ha llevado a cabo la determinación de 8 Qns en productos
apícolas Se ha utilizado la metodología QuEChERS para la extracción y la UHPLCMS/
MS para el análisis instrumental.

En el quinto se ha desarrollado un método de análisis para la determinación de 19
Qns en muestras de agua. Para el tratamiento de muestra se ha utilizado un método
basado en la metodología QuEChERS y para el análisis se ha usado la UHPLCMS/
MS.

En el último capítulo se recoge el trabajo desarrollado en el RIKILT Institute of Food
Chemistry (Wageningen, Holanda) consistente en un método de cribado para la
detección multirresiduo de diversas familias de fármacos y plaguicidas en pollo
mediante LC-HRMS.